El microscopio electrónico
Invención del microscopio electrónico
En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes
electrostáticas. Ese mismo año Knoll y Ruska dan a conocer los primeros resultados
obtenidos con un microscopio electrónico Siemens, construido con lentes magnéticas. Así
nace el microscopio electrónico. Para 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican
microscopios electrónicos que superan en resolución al microscopio óptico.
En 1932, Bruche y Johnsson construyen el primer microscopio electrónico a base de lentes
electrostáticas. Ese mismo año Knoll y Ruska dan a conocer los primeros resultados
obtenidos con un microscopio electrónico Siemens, construido con lentes magnéticas. Así
nace el microscopio electrónico. Para 1936 ya se ha perfeccionado y se fabrican
microscopios electrónicos que superan en resolución al microscopio óptico.
Estos logros no sólo representan un avance en el campo de la electrónica, sino también en
el campo de la Biología, pues son muchas las estructuras biológicas que se han descubierto
y que revelan detalles inusitados, al observarlas al microscopio electrónico.
el campo de la Biología, pues son muchas las estructuras biológicas que se han descubierto
y que revelan detalles inusitados, al observarlas al microscopio electrónico.
Funcionamiento del microscopio electrónico
El microscopio electrónico utiliza un flujo de electrones en lugar de luz. Consta
fundamentalmente de un tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vació. El
cátodo está constituido por un filamento de tungsteno, que al calentarse eléctricamente
emite los electrones, los cuales son atraídos hacia el ánodo por una diferencia de potencial
de 50.000 a 100.000 voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el
objeto que se observa, cuya preparación exige técnicas especiales. Los electrones chocan
contra la preparación, sobre la cual se desvían de manera desigual.
fundamentalmente de un tubo de rayos catódicos, en el cual debe mantenerse el vació. El
cátodo está constituido por un filamento de tungsteno, que al calentarse eléctricamente
emite los electrones, los cuales son atraídos hacia el ánodo por una diferencia de potencial
de 50.000 a 100.000 voltios. La lente del condensador enfoca este haz y lo dirige hacia el
objeto que se observa, cuya preparación exige técnicas especiales. Los electrones chocan
contra la preparación, sobre la cual se desvían de manera desigual.
Con el objetivo se enfoca la imagen, que es ampliada por la lente de proyección. Para
variar los aumentos en el microscopio electrónico basta variar la distancia focal de la lente
proyectora. Como los electrones no impresionan la retina del ojo humano, debe recogerse
la imagen del microscopio electrónico en una pantalla fluorescente, la cual posee una
superficie impregnada con fósforo o sulfuro de cinc. La imagen obtenida en esta pantalla
puede fotografiarse.
variar los aumentos en el microscopio electrónico basta variar la distancia focal de la lente
proyectora. Como los electrones no impresionan la retina del ojo humano, debe recogerse
la imagen del microscopio electrónico en una pantalla fluorescente, la cual posee una
superficie impregnada con fósforo o sulfuro de cinc. La imagen obtenida en esta pantalla
puede fotografiarse.
Se acostumbra utilizar el término microfotografías para las fotografías tomadas a través
del microscopio óptico y micrografía o electromicrografia para las que se toman en el
microscopio electrónico.
del microscopio óptico y micrografía o electromicrografia para las que se toman en el
microscopio electrónico.
Los aumentos máximos conseguidos en el microscopio electrónico son del orden de
2.000.000 (¡dos millones de aumento!) mediante el acoplamiento al microscopio
electrónico de un amplificador de imagen y una cámara de televisión. En resumen, el
microscopio electrónico consta esencialmente de:
2.000.000 (¡dos millones de aumento!) mediante el acoplamiento al microscopio
electrónico de un amplificador de imagen y una cámara de televisión. En resumen, el
microscopio electrónico consta esencialmente de:
Un filamento de tungsteno (cátodo) que emite electrones. Condensador o lente
electromagnética, que concentra el haz de electrones. Objetivo o lente electromagnética,
que amplía el cono de proyección del haz de luz. Ocular o lente electromagnética, que
aumenta la imagen. Proyector o lente proyectora. que amplía la imagen. Pantalla
fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano. Tipos de
electromagnética, que concentra el haz de electrones. Objetivo o lente electromagnética,
que amplía el cono de proyección del haz de luz. Ocular o lente electromagnética, que
aumenta la imagen. Proyector o lente proyectora. que amplía la imagen. Pantalla
fluorescente, que recoge la imagen para hacerla visible al ojo humano. Tipos de
Microscopios Electrónicos Existen varios tipos de microscopios electrónicos, que cada día
se perfeccionan más.
se perfeccionan más.
El microscopio electrónico de transmisión que utiliza un haz de electrones acelerados por
un alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una sección muy fina de la muestra,
sean tejidos, células u otro material.
un alto voltaje (cien mil voltios). Este haz ilumina una sección muy fina de la muestra,
sean tejidos, células u otro material.
El microscopio electrónico de barrido se utiliza para el estudio de la morfología y la
topografía de los elementos. Estos instrumentos utilizan voltajes cercanos a los 20.000
voltios. Las lentes magnéticas utilizan un haz muy fino de electrones para penetrar
repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada de la superficie observada en
la pantalla de un monitor. El microscopio electrónico mixto tiene propiedades comunes
con el de transmisión y con el de barrido y resulta muy útil para ciertas investigaciones.
topografía de los elementos. Estos instrumentos utilizan voltajes cercanos a los 20.000
voltios. Las lentes magnéticas utilizan un haz muy fino de electrones para penetrar
repetidamente la muestra, y se produce una imagen ampliada de la superficie observada en
la pantalla de un monitor. El microscopio electrónico mixto tiene propiedades comunes
con el de transmisión y con el de barrido y resulta muy útil para ciertas investigaciones.
Hay otros microscopios analíticos que detectan señales características de los elementos
que constituyen la muestra.
que constituyen la muestra.
Con estos poderosos instrumentos, que utilizan el flujo de electrones y las radiaciones
electromagnéticas así como la aplicación de técnicas histoquímicas y bioquímicas, además
del empleo de marcadores radiactivos, se han logrado grandes avances en la biología
celular.
electromagnéticas así como la aplicación de técnicas histoquímicas y bioquímicas, además
del empleo de marcadores radiactivos, se han logrado grandes avances en la biología
celular.
Microscopio electrónico de barrido
El microscopio electrónico de barrido está situado a la izquierda del operador, y las
imágenes computerizadas de la muestra se ven en la pantalla de la derecha. Aunque un
microscopio electrónico de transmisión puede resolver objetos más pequeños que uno de
barrido, este último genera imágenes más útiles para conocer la estructura tridimensional
de objetos minúsculos.
imágenes computerizadas de la muestra se ven en la pantalla de la derecha. Aunque un
microscopio electrónico de transmisión puede resolver objetos más pequeños que uno de
barrido, este último genera imágenes más útiles para conocer la estructura tridimensional
de objetos minúsculos.
Microscopio quirúrgico
El empleo de microscopios quirúrgicos ha permitido que los cirujanos lleven a cabo
intervenciones que parecían imposibles, como la reimplantación de un miembro y la
cirugía de los ojos y oídos. Estos microscopios son en especial útiles cuando es necesario
realinear para unir o reparar fibras nerviosas y vasos sanguíneos individuales.
intervenciones que parecían imposibles, como la reimplantación de un miembro y la
cirugía de los ojos y oídos. Estos microscopios son en especial útiles cuando es necesario
realinear para unir o reparar fibras nerviosas y vasos sanguíneos individuales.
Medición a través del microscopio
Muchas veces interesa al observador conocer el tamaño real de los objetos o
microorganismos que está observando a través del microscopio. Para estas mediciones
pueden utilizarse varios métodos.
microorganismos que está observando a través del microscopio. Para estas mediciones
pueden utilizarse varios métodos.
Método de los micrómetros. Se utiliza para esto un micrómetro de platina o de objetivo,
que consiste en un portaobjetos en cuyo centro se halla una escala graduada (de 2 mm. de
longitud), con separaciones, entre cada división, de una centésima de milímetro.
que consiste en un portaobjetos en cuyo centro se halla una escala graduada (de 2 mm. de
longitud), con separaciones, entre cada división, de una centésima de milímetro.
Además se utiliza un micrómetro ocular que lleva una escala graduada en décimas de
milímetros. Se coloca el micrómetro objetivo sobre la platina y se enfoca el microscopio
hasta que las líneas de la escala graduada aparezcan nítidas. Luego se hace superponer la
escala del ocular y se toma como referencia las primeras divisiones en que una línea del
micrómetro objetivo y una línea del micrómetro ocular coincidan o se superpongan
exactamente.
milímetros. Se coloca el micrómetro objetivo sobre la platina y se enfoca el microscopio
hasta que las líneas de la escala graduada aparezcan nítidas. Luego se hace superponer la
escala del ocular y se toma como referencia las primeras divisiones en que una línea del
micrómetro objetivo y una línea del micrómetro ocular coincidan o se superpongan
exactamente.
Luego, por simple regla de tres, se calcula el valor en mieras de cada división ocular.
Veamos un ejemplo. Si 9 divisiones del micrómetro objetivo (0,09mm) equivalen a 30
divisiones del micrómetro ocular, cada división del ocular equivaldrá a: 0,09 = 0,003 mm.
= 3 μm
Veamos un ejemplo. Si 9 divisiones del micrómetro objetivo (0,09mm) equivalen a 30
divisiones del micrómetro ocular, cada división del ocular equivaldrá a: 0,09 = 0,003 mm.
= 3 μm
Quiere decir que para el objetivo calibrado y el ocular utilizado, cada división del
micrómetro ocular equivale a 3 μm. Una vez obtenido este dato para cada objetivo en la
forma que hemos expuesto, teniendo el microscopio ocular podrían hacerse todas las
mediciones que se deseen. Para medir, por ejemplo, un Paramecium de una preparación,
procedemos así: haremos coincidir los extremos del microorganismo con las divisiones del
micrómetro ocular. Si la longitud del organismo es de 75 divisiones del micrómetro
ocular, y cada división equivale a 3 μm, la longitud del Paramecium será 75x3= 225 μm.
micrómetro ocular equivale a 3 μm. Una vez obtenido este dato para cada objetivo en la
forma que hemos expuesto, teniendo el microscopio ocular podrían hacerse todas las
mediciones que se deseen. Para medir, por ejemplo, un Paramecium de una preparación,
procedemos así: haremos coincidir los extremos del microorganismo con las divisiones del
micrómetro ocular. Si la longitud del organismo es de 75 divisiones del micrómetro
ocular, y cada división equivale a 3 μm, la longitud del Paramecium será 75x3= 225 μm.
También se pueden efectuar mediciones en el microscopio con cámara clara y utilizando
una regla. En realidad, estas medidas no son tan exactas como cuando se utilizan
micrómetros por errores que se introducen superponiendo imágenes.
una regla. En realidad, estas medidas no son tan exactas como cuando se utilizan
micrómetros por errores que se introducen superponiendo imágenes.
Mantenimiento del microscopio
El microscopio debe estar protegido del polvo, humedad y otros agentes que pudieran
dañarlo. Mientras no esté en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien cubrirlo
con una bolsa plástica o campana de vidrio.
dañarlo. Mientras no esté en uso debe guardarse en un estuche o gabinete, o bien cubrirlo
con una bolsa plástica o campana de vidrio.
Las partes mecánicas deben limpiarse con un paño suave; en algunos casos, éste se puede
humedecer con xilol para disolver ciertas manchas de grasa, aceite de cedro, parafina, etc.
Que hayan caído sobre las citadas partes.
La limpieza de las partes ópticas requiere precauciones especiales. Para ello debe
emplearse papel "limpiante" que expiden las casas distribuidoras de material de
laboratorio. Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo y condensador con los
dedos; las huellas digitales perjudican la visibilidad, y cuando se secan resulta trabajoso
eliminarlas.
Para una buena limpieza de las lentes puede humedecerse el papel "limpiante" con éter y
luego pasarlo por la superficie cuantas veces sea necesario. El aceite de cedro que queda
sobre la lente frontal del objetivo de inmersión debe quitarse inmediatamente después de
finalizada la observación. Para ello se puede pasar el papel "limpialentes" impregnado con
una gota de xilol. Para guardarlo se acostumbra colocar el objetivo de menor aumento
sobre la platina y bajado hasta el tope; el condensador debe estar en su posición más baja,
para evitar que tropiece con alguno de los objetivos. Guárdese en lugares secos, para evitar
que la humedad favorezca la formación de hongos. Ciertos ácidos y otras sustancias
químicas que producen emanaciones fuertes, deben mantenerse alejados del microscopio.
Conclusiones
El Microscopio es: cualquiera de los distintos tipos de instrumentos que se utilizan para
obtener una imagen aumentada de objetos minúsculos o detalles muy pequeños de los
mismos. El microscopio simple o lente de aumento es el más sencillo de todos y consiste
en realidad en una lupa que agranda la imagen del objeto observado. Las evidentes
limitaciones de este sistema, conocido desde la antigüedad, y el desarrollo de la óptica y
de la construcción de lentes hizo que surgieran en el siglo XVII los microscopios
compuestos, diestramente utilizados por el holandés Antonie van Leewenhock en el
estudio de la microfauna de los estanques y charlas. Estas observaciones, unidas a las de
Robert Hooke, establecieron la microscopia como poderosa herramienta científica.
Dos lentes convexas bastan para construir un microscopio. Cada lente hace converger los
rayos luminosos que la atraviesan. Una de ellas, llamada objetivo, se sitúa cerca del objeto
que se quiere estudiar. El objetivo forma una imagen real aumentada e invertida. Se dice
que la imagen es real porque los rayos luminosos pasan realmente por el lugar de la
imagen. La imagen es observada por la segunda lente, llamada ocular, que actúa
sencillamente como una lupa. El ocular está situado de modo que no forma una segunda
imagen real, sino que hace divergir los rayos luminosos, que al entrar en el ojo del
observador parecen proceder de una gran imagen invertida situada más allá del objetivo.
Como los rayos luminosos no pasan realmente por ese lugar, se dice que la imagen es
virtual.
Microscopio de luz Ultravioleta
Microscopio de luz ultravioleta – La imagen en el microscopio de luz ultravioleta
depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz
ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una
resolución de 100 nm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento
de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no
se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar
la retina. El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen
determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación
se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de
cada célula.
depende de la absorción de esa luz por las moléculas de la muestra. La fuente de luz
ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una
resolución de 100 nm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento
de un espectrofotómetro pero sus resultados son registrados en fotografías. La muestra no
se puede observar directamente a través del ocular porque la luz ultravioleta puede dañar
la retina. El método sirve para detectar ácidos nucleicos, proteínas que contienen
determinados aminoácidos. Mediante longitudes de ondas específicas para la iluminación
se puede obtener mediciones espectrofotométricas para cuantificar el DNA y el RNA de
cada célula.
El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en
lugar del rango visible, bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor
o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la
banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda más cortas de la
luz ultravioleta, los elementos ópticos de estos microscopios están hechos con cuarzo,
fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Además, dado que la radiación ultravioleta es
invisible, la imagen se muestra con fosforescencia (véase Luminiscencia ), en fotografía o
con un escáner electrónico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigación
científica.
lugar del rango visible, bien para aumentar la resolución con una longitud de onda menor
o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la
banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda más cortas de la
luz ultravioleta, los elementos ópticos de estos microscopios están hechos con cuarzo,
fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Además, dado que la radiación ultravioleta es
invisible, la imagen se muestra con fosforescencia (véase Luminiscencia ), en fotografía o
con un escáner electrónico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigación
científica.
Microscopio de Flourescencia
El microscopio de fluorescencia es una variación del microscopio de luz ultravioleta en
el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda . La
imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las
moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor
longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar
filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar
sustancias con autofluorescencia ( vitamina A ) o sustancias marcadas con fluorocromos.
el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda . La
imagen observada es el resultado de la radiación electromagnética emitida por las
moléculas que han absorbido la excitación primaria y reemitido una luz con mayor
longitud de onda. Para dejar pasar sólo la emisión secundaria deseada, se deben colocar
filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar
sustancias con autofluorescencia ( vitamina A ) o sustancias marcadas con fluorocromos.
El microscopio de fluorescencia Olympus BX61, acoplado con una cámara digital .
Microscopio de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de
un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dipersa la luz y se
hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo
iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada. Por ello las
porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y
partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones,
incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del observador. Esta
forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin
pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.
un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El objeto iluminado dipersa la luz y se
hace así visible contra el fondo oscuro que tiene detrás, como las partículas de polvo
iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitación cerrada. Por ello las
porciones transparentes del espécimen quedan oscuras, mientras que las superficies y
partículas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones,
incluida la del eje óptico que conecta el espécimen con la pupila del observador. Esta
forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin
pigmentar, invisibles con iluminación normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla.
También es bastante utilizado en la observación de muestras metalográficas para la
observación de detalles en superficies con alta reflectancia.
observación de detalles en superficies con alta reflectancia.
El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espécimen. Para
lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que
ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa
detrás de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas
brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.
lograrlo, el microscopio de campo oscuro está equipado con un condensador especial que
ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa
detrás de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeñas partículas
brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo.
El efecto es similar a las partículas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un
proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de
polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite
incluso distinguir partículas más pequeñas que el poder separador del sistema óptico usado
por transparencia.
Ammonia tepida , un foraminífero, en microscopía de fondo oscuro. Los tenues
seudópodos se ven claros, por la luz que dispersan, contra el fondo oscuro
Microscopio de contraste de fase
proyector de diapositivas en una habitación oscura. La luz reflejada por las partículas de
polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite
incluso distinguir partículas más pequeñas que el poder separador del sistema óptico usado
por transparencia.
Ammonia tepida , un foraminífero, en microscopía de fondo oscuro. Los tenues
seudópodos se ven claros, por la luz que dispersan, contra el fondo oscuro
Microscopio de contraste de fase
Microscopio de fase , se utiliza cuando se necesitan ver objetos incoloros. Si la amplitud
de la luz que incide apenas cambia, se obtiene un contraste muy malo. Se usa entonces una
iluminación por varios sitios y se miden diferencias de fase para poder "ver" el objeto.
Contraste de Fases
Una muestra microscópica normalmente se visualiza porque su densidad varía de unas
zonas a otras. Es muy difícil ver detalles de una muestra completamente transparente con
iluminación de campo claro, ya que todas las zonas son de la misma densidad. Sin
embargo, no todas tienen el mismo índice de refracción. El índice de refracción provoca
alteraciones en la fase de la onda.
SISTEMA: se coloca en el plano focal del condensador un diafragma anular que proyecta
en el infinito la imagen de un haz anular. En el plano focal del objetivo se coloca una
lamina que contiene un anillo, llamado anillo de fase, construido de forma que la luz que
pase a través de el ( la luz no difractada ) sufra una disminución en intensidad y un
desplazamiento de fase de un cuarto de longitud de onda en relación con la luz difractada.
El efecto final simula una imagen de una muestra que tuviera variaciones de densidad en
lugar de variaciones de índice de refracción.
lugar de variaciones de índice de refracción.
El contraste de fases suele utilizarse mucho para estudiar muestras transparentes vivas.
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